Мікроскоп і мікроскопічні методи дослідження

Для виявлення і дослідження мікроорганізмів застосовують мікроскопи. Світлові мікроскопи призначені для вивчення мікроорганізмів, що мають розміри не менше 0,2 мкм (бактерії, найпростіші тощо) a електронні для вивчення більш дрібних мікроорганізмів (віруси) та дрібних структур бактерій. Сучасні світлові мікроскопи - це складні оптичні прилади, поводження з якими потребує певних знань, навичок і великої акуратності. Світлові мікроскопи поділяються на студентські, робочі, лабораторні та дослідні, розрізняються по конструкції та комплектації оптикою. Вітчизняні мікроскопи (Біола", "Бимам", "Микмед") мають позначення, що вказують, до якої групи вони належать (З - студентські, Р - робітники, Л - лабораторні, І - дослідні), комплектація позначається цифрою.
В мікроскопі розрізняють механічну і оптичну частини. До механічної частини відносяться: штатив (що складається з основи і тубусодержателя) і укріплені на ньому тубус з револьвером для кріплення і зміни об'єктивів, предметний столик для препарату, пристосування для кріплення конденсора і світлофільтрів, а також вбудовані в штатив механізми для грубого (макромеханизм, макровинт) і тонкого (микромеханизм, микровинт) переміщення предметного столика або тубусодержателя. Оптична частина мікроскопа представлена об'єктивами, окулярами та освітлювальною системою, яка в свою чергу складається з розташованих під предметним столиком конденсора Аббе, дзеркала, має плоску та ввігнуту сторону, а також окремого або вбудованого освітлювача. Об'єктиви угвинчуються в револьвер, а відповідний окуляр, через який спостерігають зображення, встановлюють з протилежного боку тубуса. Розрізняють монокулярний (має один окуляр) та бінокулярний (має два однакових окуляра) тубуси.
Принципова схема мікроскопа і освітлювальної системи 1. Джерело світла; 2. Колектор; 3. Ірисова польова діафрагма; 4. Дзеркало; 5. Ірисова аппертурная діафрагма; 6. Конденбсор; 7. Препарат; 7'. Збільшене дійсне проміжне зображення препарату, утворене ; об'єктивом; 7". Збільшене уявне остаточне зображення препарату, що спостерігається в окулярі; 8. Об'єктив; 9. вихідний значок об'єктива; 10. Польова діафрагма окуляра; 11. Окуляр; 12. Очей.
Основну роль в отриманні зображення грає об'єктив. Він будує збільшене, дійсне і перевернуте зображення об'єкта. Потім це зображення додатково збільшується при розгляданні його через окуляр, який аналогічно звичайної лупі дає збільшене уявне зображення. Збільшення мікроскопа орієнтовно можна визначити, помноживши збільшення об'єктива на збільшення окуляра. Однак збільшення не визначає якості зображення. Якість зображення, чіткість, визначається роздільною здатністю мікроскопа, тобто можливістю розрізняти окремо дві близько розташовані точки. Межа дозволу — мінімальна відстань, на якому ці точки видно роздільно,— залежить від довжини хвилі світла, яким освітлюється об'єкт, і числової апертури об'єктива. Числова апертура, в свою чергу, залежить від кутової апертури об'єктиву і показника заломлення середовища, що знаходиться між фронтальною лінзою об'єктива і препаратом. Кутова апертура—це максимальний кут, під яким можуть потрапляти в об'єктив промені, які пройшли через об'єкт. Чим більше апертура і чим ближче показник заломлення середовища, що знаходиться між об'єктивом і препаратом, до показника заломлення скла, тим вище роздільна здатність об'єктива. Якщо вважати апертуру конденсора рівній апертурі об'єктива, то формула роздільної здатності має наступний вигляд:
де R - межа дозволу; - довжина хвилі; NA - числова апертура.
Розрізняють корисне і марне збільшення. Корисне збільшення зазвичай одно числовий апертурі об'єктива, збільшеної в 500-1000 разів. Більш висока окулярна збільшення не виявляє нових деталей і є марним. В залежності від середовища, яка знаходиться між об'єктивом і препаратом, розрізняють «сухі» об'єктиви малого і середнього збільшення (до 40 х) і иммерсионные з максимальною апертурою і збільшенням (90-100 х). «Сухий» об'єктив - це такий об'єктив, між фронтальною лінзою якого і препаратом, знаходиться повітря.
Особливістю імерсійним об'єктивів є те, що між фронтальною лінзою такого об'єктива і препаратом поміщають иммерсионное рідину, що має показник заломлення такий же, як скло (або близький до нього), що забезпечує збільшення числової апертури і роздільної здатності об'єктива. Як імерсійної рідини для об'єктивів водної імерсії використовують дистильовану воду, а для об'єктивів масляної імерсії—кедрове масло або спеціальне синтетичне иммерсионное масло. Використання синтетичного иммерсионного масла переважніше, оскільки його параметри більш точно нормуються, і воно на відміну від кедрового, не засихає на поверхні фронтальної лінзи об'єктива. Для об'єктивів, які працюють в ультрафіолетовій області спектра, в якості імерсійної рідини використовують гліцерин. Ні в якому разі не можна користуватися сурогатами иммерсионного масла і, зокрема, вазеліновим маслом. **Зображення, отримане за допомогою лінз, володіє різними вадами: сферичної і хроматичною аберацією, кривизною поля зображення та ін. В об'єктивах, що складаються з кількох лінз, ці недоліки в тій чи іншій мірі виправлені. Залежно від ступеня виправлення цих недоліків розрізняють об'єктиви ахроматы і більш складні апохроматы. Відповідно об'єктиви, в яких виправлена кривизна поля зображення, називаються планахроматами і планапохроматами. Використання цих об'єктивів дозволяє одержати різке зображення по всьому полю, тоді як зображення, отримане за допомогою звичайних об'єктивів, не має однакової різкості в центрі і на краях поля зору. Всі характеристики об'єктива зазвичай викарбувані на його оправі: власне збільшення, діафрагма, тип об'єктиву (АПО - апохромат тощо); об'єктиви водної імерсії мають позначення ВІ і біле кільце навколо оправи в нижній її частині, об'єктиви масляної імерсії—позначення МІ і чорне кільце. Всі об'єктиви розраховані для роботи з покривним склом товщиною 0,17 мм Товщина покривного скла особливо впливає на якість зображення при роботі з сильними сухими системами (40 х). При роботі з иммерсионными об'єктивами не можна користуватися покривними стеклами товщі 0,17 мм, бо товщина покривного скла може виявитися більше, ніж робоча відстань об'єктива, і в цьому випадку, при спробі сфокусувати об'єктив на препарат, може бути пошкоджена фронтальна лінза об'єктива. Окуляри складаються з двох лінз і теж бувають кількох типів, кожен з яких застосовується з певним типом об'єктива, додатково усуваючи недоліки зображення. Тип окуляра і його збільшення позначені на його оправі. Конденсор призначений для того, щоб сфокусувати на препараті світло від освітлювача, що направляється дзеркалом мікроскопа або освітлювача (у разі використання накладного або вбудованого освітлювача). Однією з деталей конденсора є апертурна діафрагма, яка має важливе значення для правильного освітлення препарату. Освітлювач складається з низьковольтної лампи розжарювання з товстою ниткою, трансформатора, колекторної лінзи і польовий діафрагми, від розкриття якої залежить діаметр освітленого поля на препараті. Дзеркало, що скеровує світло від освітлювача в конденсор. Для того щоб зберегти паралельність променів, що йдуть від освітлювача в конденсор, необхідно використовувати тільки плоску сторону дзеркала.
Налаштування освітлення н фокусування мікроскопа Якість зображення значною мірою залежить також від правильного освітлення. Існує кілька різних способів освітлення препарату при мікроскопії. Найбільш поширеним є спосіб установки світла по Келеру, який полягає в наступному: 1) встановлюють освітлювач проти дзеркала мікроскопа; 2) включають лампу освітлювача і направляють світло на плоске (!) дзеркало мікроскопа; 3)препарат поміщають на предметний столик мікроскопа; 4) закривають дзеркало мікроскопа аркушем білого паперу і фокусують на ньому зображення нитки лампи, пересуваючи патрон лампи в освітлювачі; 5) прибирають аркуш паперу з дзеркала; 6) закривають апертурную діафрагму конденсора. Переміщаючи дзеркало і злегка пересуваючи патрон лампи, фокусують зображення нитки на апертурної діафрагми. Відстань від освітлювача мікроскопа повинно бути таким, щоб зображення нитки лампи було дорівнює діаметру апертурної діафрагми конденсора (спостерігати апертурную діафрагму можна за допомогою плоского дзеркала, поміщеного з правої сторони підстави мікроскопа). 7)відкривають апертурную діафрагму конденсора, зменшують отвір польовий діафрагми освітлювача і значно зменшують напруження лампи; 8) при малому збільшенні (10х), дивлячись в окуляр, отримують різке зображення препарату; 9)злегка повертаючи дзеркало, переводять зображення польовий діафрагми, яке має вигляд світлої плями, в центр поля зору. Опускаючи і піднімаючи конденсор, домагаються отримання різкого зображення країв польовий діафрагми в площині препарату (навколо них може бути видна кольорова облямівка); 10) розкривають польову діафрагму освітлювача до країв поля зору, збільшують накал нитки лампи і злегка (на 1/3) зменшують розкриття апертурної діафрагми конденсора; 11)під час зміни об'єктива необхідно перевірити налаштування світла. Після закінчення налаштування світла по Келеру не можна змінювати положення конденсораf розкриття польовий і апертурної діафрагми. Освітленість препарату можна регулювати тільки нейтральними світлофільтрами або зміною розжарення лампи за допомогою реостата. Зайве відкриття апертурної діафрагми конденсора може призвести до значного зниження контрасту зображення, а недостатнє - до значного погіршення якості зображення (появи диффракционных кілець). Для перевірки правильності розкриття апертурної діафрагми необхідно видалити окуляр і, дивлячись в тубус, відкрити її таким чином, щоб вона закривала світиться поле на одну третину. Для правильного освітлення препарату при роботі з об'єктивами малого збільшення (до 10х) необхідно відгвинтити і зняти верхню лінзу конденсора. Увага! При роботі з об'єктивами, дають велике збільшення - з сильними сухими (40х) і иммерсионными (90х) системами, щоб не пошкодити фронтальну лінзу, при фокусуванні користуються наступним прийомом: спостерігаючи збоку, опускають об'єктив макровинтом майже до зіткнення з препаратом, потім, дивлячись в окуляр, макровинтом дуже повільно піднімають об'єктив до появи зображення і з допомогою микровинта проводять остаточну фокусування мікроскопа.
Догляд за мікроскопом При роботі з мікроскопом не можна застосовувати великі зусилля. Не можна торкатися пальцями поверхні лінз, дзеркал та світлофільтрів. Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию. З дзеркал, що мають зовнішнє сріблення, можна тільки видаляти пил, здуваючи її гумовою грушею. Протирати їх не можна. Не можна також самостійно розгвинчувати і розбирати об'єктиви — це призведе до їх псування. По закінченні роботи на мікроскопі необхідно ретельно видалити залишки иммерсионного олії з фронтальної лінзи об'єктива зазначеним вище способом. Потім опустити предметний столик (або конденсор в мікроскопах з нерухомим столиком) і накрити мікроскоп чохлом. Для збереження зовнішнього вигляду мікроскопа необхідно періодично протирати його м'якою ганчіркою, злегка просоченої бескислотным вазеліном і потім сухою м'якою чистою ганчіркою.